如何利用單光子計(jì)數(shù)相機(jī)輕松搞定FLIM/FRET

對于高精度多光子FLIM，時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）在測量精度方面非常優(yōu)秀。就成像速度而言，由于發(fā)射過程的隨機(jī)性，要求檢測率遠(yuǎn)小于每個(gè)激發(fā)事件一個(gè)光子，以防止壽命擬合中的不確定性，導(dǎo)致TCSPC在光子計(jì)數(shù)率方面受到了極大的限制，于是，激光掃描FLIM的采集時(shí)間大約需要幾分鐘才能完成，然而在這個(gè)時(shí)間尺度上，許多動態(tài)生物事件已經(jīng)發(fā)生并結(jié)束。

為了克服該限制，可以采用激光束陣列激發(fā)，并配合光電倍增管陣列或時(shí)間門控相機(jī)檢測系統(tǒng)來進(jìn)行并行信號采集實(shí)現(xiàn)。迄今為止，由于多陽極PMT中的串?dāng)_，亦或是由于相機(jī)系統(tǒng)中的測量方法導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差，大大的限制了并行采集大量通道熒光壽命數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。當(dāng)然，對于單光束掃描系統(tǒng)而言，能通過多陽極PMT中的并行檢測來消除計(jì)數(shù)率限制，從而達(dá)到增加幀速率的目的，但與此同時(shí)，脈沖堆積效應(yīng)導(dǎo)致觀察到的熒光壽命中的計(jì)數(shù)率依賴性誤差比較嚴(yán)重。此外，各大應(yīng)用中常見的在軸向和橫向都具有較低分辨率的體內(nèi)成像技術(shù)，在沒有飽和激發(fā)、顯著光毒性和光漂白的情況下，高NA物鏡是不可能實(shí)現(xiàn)。因此，以高時(shí)間分辨率定量測量復(fù)雜生物事件的能力仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

然而，開發(fā)用于顯微鏡和光譜技術(shù)的SPAD陣列+TDC 單光子計(jì)數(shù)相機(jī)對于高時(shí)間分辨率定量測量復(fù)雜生物事件是至關(guān)重要的。這里使用的32×32 SPAD陣列相機(jī)，其中每個(gè)像素包含單獨(dú)的定時(shí)電路。在新型多焦點(diǎn)、多光子FLIM顯微鏡（MM-FLIM）中，通過并行激發(fā)和檢測過程，顯著提高了高分辨率熒光壽命成像的采集速率。該系統(tǒng)的激發(fā)部分為二維超快光束陣列（通過SLM全息生成），該光束共軛并精確對準(zhǔn)SPAD陣列+TDC 單光子計(jì)數(shù)相機(jī)。將收集的熒光小束直接重新成像到SPAD的光敏感區(qū)域上，填充因子光學(xué)放大到100％。每個(gè)SPAD在TCSPC模式下運(yùn)行時(shí)，顯微鏡系統(tǒng)有效地由64個(gè)單獨(dú)的多光子FLIM顯微鏡組成，這些顯微鏡并行工作從而實(shí)現(xiàn)高數(shù)據(jù)采集速率。

PF32 SPAD陣列+TDC 單光子計(jì)數(shù)相機(jī)是武漢東隆科技有限公司中國區(qū)總代理，它是一款32*32面陣SPAD探測器，區(qū)別于一般的SPAD面陣探測器，PF32 SPAD陣列+TDC 單光子計(jì)數(shù)相機(jī)的1024個(gè)單光子敏感SPAD像素陣列，都具有超快的55ps 時(shí)間分辨率TDC 電子元件，從而形成了一個(gè)并行的，功能強(qiáng)大，高度緊湊的系統(tǒng)。這種并行性讓生命科學(xué)、量子成像、激光雷達(dá)抑或是單光子成像領(lǐng)域的科研工作者，更加方便、簡單的獲取和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

S. Poland et al., “A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging "

Biomedical Optics Express Vol. 6, Issue 2, pp. 277-296 (2015)